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技術(shù)專題

回顧2016海貍磁珠重大應(yīng)用系列專題一

——HIV-1整合酶抑制劑檢測(cè)

回顧2016海貍磁珠重大應(yīng)用系列專題一

——HIV-1整合酶抑制劑檢測(cè)

       HIV-1(I型人類免疫缺陷病毒)在宿主細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA,由整合酶(inergrase,IN)催化插入到宿主基因組DNA中,該過(guò)程稱為整合過(guò)程。整合是HIV-1復(fù)制周期中不可缺少的步驟,對(duì)于病毒的復(fù)制至關(guān)重要,因此對(duì)整合酶的抑制能夠有效地起到抗HIV的作用。
       目前,F(xiàn)DA批準(zhǔn)的治療方案以HIV-1生命周期的三個(gè)階段——融合過(guò)程、逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程和蛋白水解過(guò)程為靶點(diǎn)。這三個(gè)靶點(diǎn)的抑制劑相結(jié)合的聯(lián)合療法,通常稱為高效抗病毒療法,是目前治療AIDS的標(biāo)準(zhǔn)方案。盡管這種方法能夠顯著的抑制HIV-1的復(fù)制,提高了感染病人的生活質(zhì)量,但并不能有效治愈。而且,耐藥病毒的突變株的出現(xiàn),使得整個(gè)治療方案受到明顯的限制。因此,新的抗病毒靶點(diǎn)的研究對(duì)于AIDS的治療有著重要意義。細(xì)胞輔因子LEDGF/p75對(duì)整合酶具有穩(wěn)定作用,在LEDGF/p75缺陷的感染細(xì)胞中,整合酶很快被降解,HIV-1的復(fù)制和感染被阻斷,大量研究證明干擾LEDGF/p75的作用是抑制HIV復(fù)制感染的有效途徑。
       中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院郭順星和孟志霞等人利用磁性微球的生化分析方法,開(kāi)發(fā)了一種新型的針對(duì)于HIV整合酶和細(xì)胞輔因子LEDGF/p75之間的蛋白質(zhì)相互作用的篩選方法,以鑒定HIV-1整合酶抑制劑。此外,該方法亦能夠適用于FDA批準(zhǔn)的其他1000多種PPI(protein-protein interaction)藥物篩查。

該檢測(cè)方法主要步驟如下圖A:
a)GST-IBD與His-CCD置于微孔板中孵育結(jié)合,形成PPI復(fù)合物
b)采用鎳離子螯合磁珠(BEAVER,70501)捕獲PPI復(fù)合物
c)采用堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的GST抗體和ALP發(fā)光底物進(jìn)行PPI復(fù)合物的定量檢測(cè)當(dāng)PPI抑制劑存在時(shí),GST-IBD無(wú)法形成PPI復(fù)合物,因此磁珠無(wú)法捕獲GST-IBD,從而無(wú)發(fā)光信號(hào)。


圖A) 采用磁珠法進(jìn)行PPI復(fù)合物抑制劑檢測(cè)的主要步驟:首先,GST-IBD與His-CCD置于微孔板中孵育結(jié)合,形成PPI復(fù)合物。然后,采用鎳離子螯合磁珠(BEAVER,70501)捕獲PPI復(fù)合物。繼而采用ALP標(biāo)記的GST抗體和ALP發(fā)光底物進(jìn)行PPI復(fù)合物的定量檢測(cè)。CCD和IBD分別是整合酶和p75蛋白上的相互作用區(qū)域,當(dāng)存在抑制劑時(shí),CCD與IBD無(wú)法作用,即無(wú)發(fā)光值。

參考文獻(xiàn):
A Novel Assay for Screening Inhibitors Targeting HIV Integrase LEDGF/p75 Interaction Based on Ni2+ Coated Magnetic Agarose Beads. Sci Rep. 2016 May 3; 6:25375.

備注:更多關(guān)于海貍產(chǎn)品應(yīng)用文獻(xiàn)請(qǐng)參考官網(wǎng)http://www.urnextcar.com產(chǎn)品信息一欄

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