應(yīng)用案例

應(yīng)用簡介：

本研究利用His標(biāo)簽蛋白純化磁珠，純化帶有His6- MBP標(biāo)簽的Cas1、Cas2、Cas4 三個蛋白，結(jié)合MBP Pull-down分析，揭示Cas1、Cas2、Cas4 三個蛋白間的互作關(guān)系。

文獻(xiàn)解析：

2021年2月22日，四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室陳強教授團隊，在Nucleic Acids Research（IF=11.501）在線發(fā)表了標(biāo)題為“Mechanisms of spacer acquisition by sequential assembly of the adaptation module in Synechocystis”的研究成果。該團隊研究人員通過利用His標(biāo)簽蛋白純化磁珠（BeaverBeads^? IDA-Nickel cat. 70501），純化帶有His 6-MBP標(biāo)簽的Cas1、Cas2、Cas4 三個蛋白，結(jié)合MBP Pull-down（圖1）分析及其他生物化學(xué)實驗，揭示了Cas1、Cas2、Cas4 三個蛋白間的互作關(guān)系，并且解析了Cas1-Cas2-Spacer三元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（圖2）和Cas1-Cas4二元復(fù)合物的電鏡負(fù)染結(jié)構(gòu)（圖3），闡明了Cas4參與外源DNA捕獲與整合的新機制。

圖1.MBP pull-down 分析

圖2.Cas1-Cas2-Spacer三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)

圖3.Cas1-Cas4二元復(fù)合物結(jié)構(gòu)

該團隊認(rèn)為，在I-D 型系統(tǒng)中， Cas4和Cas2會競爭性地與Cas1結(jié)合，可以形成 Cas1-Cas4和 Cas1-Cas2-Spacer 兩種復(fù)合物，這兩種復(fù)合物按次序先后參與間隔序列的整合。I-D型系統(tǒng)的間隔序列整合分為兩個步驟：1）間隔序列的加工；2）間隔序列的整合。在此過程中，Cas1-Cas4復(fù)合物通過Cas4的PAM序列特異性的內(nèi)切酶活性對間隔序列進行識別和加工，加工成熟的間隔序列又與Cas1、Cas2形成比Cas1-Cas4復(fù)合物更加穩(wěn)定的Cas1-Cas2-Spacer復(fù)合物，將間隔序列插入到CRISPR位點，完成間隔序列的整合。

CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于全球?qū)嶒炇遥瑢RISPR-Cas系統(tǒng)更加深入的了解不僅拓寬了人類的知識邊界，還有助于開發(fā)更新一代的基因編輯工具。（部分內(nèi)容來源于網(wǎng)絡(luò)）

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